PRÁTICA DE INDUÇÃO DA EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM ESCHERICHIA COLI

Resumo

A base de recursos naturais da biotecnologia microbiana são os microrganismos. Teoricamente, os passos para obtenção de proteínas recombinantes são simples. O gene de interesse é selecionado, é realizada a clonagem em um vetor que se tenha à disposição, o mesmo é transformado no hospedeiro escolhido, a expressão é induzida e, então, a proteína está pronta para purificação e caracterização. O objetivo desta aula prática foi instrumentar os alunos em metodologias apropriadas para a indução da expressão de proteínas heterólogas em Escherichia coli. Foram utilizadas células de Escherichia coli linhagem BL21(DE3) pLys S já transformadas com o vetor de expressão pGEX 4T-1 contendo gene da quitinase CHI2 do fungo entomopatógeno Metarhizium anisopliae. O pré-inóculo foi feito colocando uma colônia de E. coli transformada com pGEX 4T-1 para crescer em meio Luria-Bertani líquido com ampicilina a 37 ºC e 250 RPM até a saturação do meio com células. Após, 10 mL do pré-inóculo foram adicionados a 100 mL de meio LB líquido e cultivadas nas mesmas condições até atingir-se a absorbância de 0,6 em comprimento de onda de 600 nm. Um mL foi retirado antes da indução como controle negativo (não induzido) do experimento. A indução foi realizada adicionado Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosida estéril ao inóculo. As células foram cultivadas por 3 h nas mesmas condições acima descritas. Após, o frasco contendo as células foram mantidos em gelo durante 5 min. Após, o meio de cultura com células foi centrifugada a 5.000 g por 5 min. O sobrenadante foi removido, o pellet de células foi ressuspendido em água estéril e foi centrifugado novamente. O sobrenadante foi novamente descartado e as células mantidas a -20 ºC até o momento da análise da expressão. No momento da análise, as células foram lisadas utilizando a metodologia freeze-thaw, que consiste em congelar as células utilizando nitrogênio líquido e descongelá-las rapidamente em banho-maria a 37 ºC por repetidos ciclos até o rompimento completo das células. As células lisadas foram centrifugadas e tanto o sobrenadante quanto pellet de células foram analisados. Proteínas expressas de forma insolúvel (corpos de inclusão) são detectas no pellet (fração insolúvel) e proteínas expressas de forma solúvel localizam-se no sobrenadante (fração solúvel). A análise foi realizada através por SDS-PAGE 12%. . A expressão heteróloga da proteína CHI2 foi efetiva, possuindo cerca de 65 kDa, aparecendo tanto na fração induzida insolúvel quanto na induzida solúvel. A partir deste experimento é possível realizar a purificação da proteína expressa e sua caracterização bioquímica. Ainda, pode-se alterar o protocolo de indução com o intuito de aumentar a massa de proteína expressa na fração solúvel, como a diminuição da temperatura de cultivo, o aumento do tempo de cultivo e a redução da concentração molar do indutor. A prática de indução de expressão heteróloga de proteínas demonstrou ter sido exitosa, conseguindo, portanto, transmitir de forma satisfatória os princípios da expressão heteróloga de proteínas, capacitando os alunos a exercer atividades relacionadas a este tópico e fornecendo conhecimentos que contribuirão para sua atuação profissional.