VALIDAÇÃO IN SILICO DE MARCADORES SSR DE EUGENIA UNIFLORA E TRANSFERIBILIDADE PARA SETE ESPÉCIES DE EUCALYPTUS

Resumo

Com o avanço das técnicas de sequenciamento de nova geração (NGS), tem-se possibilitado o sequenciamento do genoma de espécies de interesse econômico, com custos relativamente baixos, desenvolvendo primers capazes de amplificar regiões ricas em microssatélites. A validação dos marcadores é de extrema importância, pois, é através dela que se obterá resultados confiáveis e adequados. Em relação aos testes de transferibilidade in silico, os quais requerem um banco de dados que possua informações de sequências gênicas da espécie em estudo, sendo ele o banco de dados de Sequências Expressas (EST). ESTs são marcadores de interesse pois controlam características fenotípicas importantes economicamente e permitem avaliar a distribuição de marcadores moleculares microssatélites em regiões transcrita e não transcrita. Espécies economicamente importantes da família Myrtaceae foram escolhidas para o estudo, sendo elas Eugenia uniflora e Eucalyptus spp. O presente estudo teve como objetivo validar primers de E. uniflora e testar sua transferibilidade para sete espécies de Eucalyptus. Para tal, foram utilizados dados obtidos no sequenciamento, montagem do rascunho do genoma de E. uniflora, prospecção de microssatélites e desenho de primers. A validação dos primers foi realizada através de uma simulação de eletroforese em gel. Após, obteve-se os bancos de dados de ESTs do Taxonomy browser, no site do NCBI, para sete espécies de Eucalyptus, sendo necessária a retirada de redundância, pois o banco de dados não possui curadoria e isso implica na possibilidade de muitas de suas sequências serem repetidas. As sequências repetidas foram excluídas e, por fim, realizou-se a simulação da PCR in silico. Da validação dos primers através dos géis, de um total de 111 primers testados, 80 primers amplificaram apenas um locus na região avaliada, demonstrando ser viáveis para a amplificação em laboratório. Dezoito primers apresentaram amplificação de dois loci na região avaliada e necessitam ser analisados em laboratório para ajustes na concentração de reagentes e temperaturas de anelamento. Contudo, 13 primers apresentaram amplificação de loci sobrepostos ou acima de três loci na região avaliada, tornando assim sua avaliação inviável. Para a transferibilidade através da comparação dos primers SSR de Eugenia uniflora (111) com os bancos de dados de EST de Eucalyptus por PCR virtual, obtivemos o número de primers transferíveis para cada espécie. O maior número de primers transferíveis foi para E. gunni (95), seguido de E. camaldulensis (94), E. globulus (89), E. pellita (86) E. grandis (84), E. urophylla (76) e E. tereticornis (35). A transferibilidade de primers foi relativamente alta quando comparada com dados presentes na literatura, obtendo sucesso. Porém, o fato de algumas espécies terem uma transferibilidade baixa, pode se dar também pelo baixo número de sequências disponíveis no banco de dados. Esses marcadores apresentam um alto custo para seu desenvolvimento e, por isso, uma alternativa de barateamento é de extremo interesse. Conclui-se que através da validação dos primers houve redução nos custos laboratoriais, e havendo possibilidade de transferibilidade dos primers SSR de Eugenia uniflora para as sete espécies de Eucalyptus.