Alterações na atividade da iNOS e das ectonucleotidades em astrócitos tratados com meio condicionado e cocultivados com glioma C6

Resumo

Glioblastoma multiforme, o tumor cerebral primário mais comumente diagnosticado e agressivo em adultos com um período de sobrevida médio de 14 meses, é caracterizado por um conjunto de astrócitos neoplásicos pouco diferenciados com alto potencial invasivo e alto grau de angiogênese. Para o desenvolvimento desses tumores não basta apenas a presença de células tumorais, a existência de um microambiente favorável está relacionada com o aumento de malignidade, a indução da proliferação e o desenvolvimento de células resistentes à quimioterapia. O aumento da atividade da óxido nítrico sintase induzida (iNOS), que age em termos de angiogênese e desenvolvimento neuronal, bem como alterações na sinalização purinérgica, de forma a aumentar a metabolização de nucleotídeos extracelulares para levar a um aumento de adenosina cuja atividade imunossupressora é altamente conhecida, têm sido relatadas como fatores que modulam positivamente o microambiente levando ao estabelecimento do tumor. Neste trabalho verificamos a influência de meio condicionado de glioma C6 (MC-C6) bem como o co-cultivo dessa mesma linhagem celular em cultivos primários de astrócitos de ratos neonatos, avaliando posteriormente a atividade da enzima iNOS bem como a metabolização de ATP, ADP e AMP extracelulares nessas condições de cultivo. Astrócitos corticais foram cultivados de acordo com o protocolo descrito por Gottfried (1999), em que ratos de 1-3 dias são eutanasiados, seus cérebros são retirados e seus córtices são isolados, limpos e dissociados, posteriormente as células são semeadas 1,5x105 por poço em uma placa de 24 poços. Após a maturação das células, entre 15 e 21 dias, os astrócitos foram tratados com MC-C6 ou submetidos a cocultura com linhagem C6 (10mil células por poço) por 24h e 48h, respectivamente. Após este período, o sobrenadante foi coletado para a medição da atividade da iNOS via reagente de Griess, já a atividade das ectonucleotidases foi avaliada pelo método do verde de malaquita, após incubação com nucleotídeos (ATP, ADP e AMP) em concentrações conhecidas (3mM, 3mM e 1mM, respectivamente) por 10 minutos a 37°C. A exposição de astrócitos, a MC-C6 aumentou em 4,1 vezes a hidrólise de ADP, quando comparados com os controles, astrócitos sozinhos ou C6 sozinha. Do mesmo modo, a hidrólise de ATP e AMP foram aumentadas em 2,43 e 3,24 vezes, respectivamente, em condições de cocultivo, quando comparado com os astrócitos ou glioma C6 cultivadas sozinhas. Além disso, o cocultivo de astrócitos e células de glioma C6 induziu um aumento de 15,28 vezes na atividade da iNOS. Os resultados obtidos corroboram com a suposição do estabelecimento de uma relação entre o glioma e suas células adjacente, astrócitos, atuando em termos de indução de malignidade via estimulação da atividade da iNOS bem como indução de supressão de respostas imunes devido à indução do acúmulo de adenosina pelo metabolismo de nucleotídeos extracelulares.