ISOLAMENTO E CULTIVO DE MACRÓFAGOS OVINOS OBTIDOS A PARTIR DE MONÓCITOS SANGUÍNEOS

Resumo

Os monócitos e macrófagos são células que desempenham papel fundamental na resposta imune e são susceptíveis a diversos patógenos. O estudo da funcionalidade destes auxilia na compreensão de aspectos da resposta inflamatória, interações celulares e patogenia de agentes infecciosos. O objetivo do estudo foi padronizar a obtenção e cultivo in vitro de monócitos/macrófagos a partir de sangue ovino. Para isso, amostras de sangue periférico foram utilizadas como fonte das células. O sangue foi coletado de animais saudáveis pela punção da veia jugular, com o uso do sistema de vácuo e frascos contendo anticoagulante (EDTA). Inicialmente padronizou-se a separação das células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) utilizando dois protocolos distintos: gradiente de separação e tampão de hemólise. Para separação por gradiente, sangue total (8 mL) foi misturado com Ficoll-Paque (GE Healthcare) (4 mL) e centrifugados a 400 x g, 30 min à 20ºC. Após isso, a camada intermediária foi coletada e lavada com solução salina (PBS estéril). Para o protocolo de hemólise, utilizou-se tampão de hemólise pH 7,4 (7,5 mL) e sangue (3 mL), seguida de centrifugação a 3.500 rpm, 10 min à 4ºC. Posterior a isso, o pellet celular foi lavado com a mesma solução até remoção das hemácias. Após separação inicial, as células foram contadas pelo métodos de Azul de Tripan em câmara de Neubauer. Uma suspensão de 1x106 células/mL, para cada método, foi cultivada individualmente em um poço de placa de 6 cavidades, contendo meio RPMI (1,8 mL), soro fetal bovino (0,2 mL) e mantidas à 37°C e 5% de CO2. Após 24 horas de incubação, as células não aderidas foram removidas por lavagem, o meio de cultivo reposto e as culturas retornaram à estufa por sete dias. Ao final deste período, as células aderidas foram coradas com panótico rápido para avaliação da morfologia e identificação das células compatíveis com macrófagos. As condições da separação por gradiente resultaram em um pellet celular com a presença de hemácias. No entanto, a separação dos PBMCs com a utilização do tampão de hemólise resultou em um pellet com menor presença de hemácias e formado, majoritariamente, por células morfologicamente uniformes (células grandes, circulares e com núcleo esférico). Ao final dos oito dias de cultivo, a avaliação morfológica revelou a presença de inúmeras células aderidas com características epiteliais e de macrófagos em ambos os métodos de obtenção. Entretanto, no protocolo que utilizou tampão de hemólise observou-se uma maior quantidade de células aderidas quando comparado com a purificação por gradiente. Assim sendo, conclui-se que as células com características de macrófagos de origem ovina podem ser obtidas de forma eficaz com o uso de tampão de hemólise. A identidade e funcionalidade dos macrófagos deve ser avaliada para confirmação definitiva. Após isso, estas células poderão ser utilizadas para ensaios de fagocitose, replicação viral e outras análises imunológicas.