CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E FUNCIONAL DE UMA ISOFORMA DE TROMBINA-LIKE DE BOTHROPS PICTUS (TSCHUDI, 1845)

Resumo

A serpente Bothrops pictus (Tschudi, 1845) é uma espécie importante já que além de ser endêmica do Perú sua peçonha possui uma atividade eminentemente proteolítica e pro-coagulante, sugerindo a presença de enzimas serinoproteasas, capazes de atuar ao nível da cascada de coagulação sanguínea, especificamente na via fibrinogenolítica (Fator I) estas receberam o nome de Trombina like. No presente trabalho se caracterizou estrutural e funcionalmente uma isoforma de enzima semelhante a trombina a partir do veneno total de B. pictus o qual foi fornecido pelo Departamento Acadêmico de Microbiologia e Parasitologia da Faculdade de Ciências Biológicas da Universidade Nacional de Trujillo. Os estudos necessários para caraterização estrutural da proteína, foram realizados no Laboratório de Espectrometria de Massas Thomson, do Instituto de Química UNICAMP na responsabilidade do Prof. Luis A. Ponce Soto Ph.D. Assim mesmo se realizaram duas etapas cromatográficas: cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) e cromatografia de troca iônica em SP-Sephadex C-50; A trombina "like" foi obtida com um alto grau de homogeneidade molecular e pureza, sem perda de atividade biológica. A determinação da atividade fibrinogenolítica foi medida quantitativamente pelo método descrito por Ware e Seegers (1949). O fibrinogênio bovino 2 mg/mL foi utilizado como substrato para o TL-Bp-2. A atividade coagulante foi determinada medindo-se o tempo de coagulação primeiro sinal de formação da rede de fibrina. Para a degradação do fibrinogênio foi realizado num gel descontínuo de Poliacrilamida (SDS-PAGE) segundo o método estabelecido por Ware y Seegers (1949) e modificada por Rodrigues et al.,(2000). A TL-Bp-2 sometida a eletroforeses em SDS-PAGE, mostrou uma massa relativa de 31 kDa em condições redutoras e com maior exatidão mediante espectrometria de massa MALDI-TOF com uma massa de 26,297kDa. Para o analise estrutural da sequência foi suficiente a sequência de 5 peptídeos trípticos gerados a partir da fração II-2 da cromatografia de IC em SP-Sephadex C-50, os quais foram sometidos a um analise de homologia sequencial utilizando a base de dados http://www.expasy.org./cgi-bin/blast.pl, com o qual se conferiu que esta serinoproteasa é uma isoforma de TLE-Bp (Vivas et al.2015). A fração de TL-Bp-2 do pico II-2 da cromatografia de troca iônica evidenciou atividade fibrinogenolítica sobre o fibrinogênio bovino comercial (2 mg/mL) hidrolisando a cadeia alfa (α) e beta (β) e comportando-se como uma trombina "like" tipo venombina AB.