DESENHO RACIONAL IN SILICO E SÍNTESE ARTIFICIAL DE UM VETOR PARA EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS

Resumo

A expressão de proteína heteróloga é uma ferramenta biotecnológica importante, e tem sido extensivamente utilizada para a obtenção de proteínas específicas em quantidade suficiente para estudos de sua estrutura e função ou para aplicações clínicas e/ou industriais. O hospedeiro mais comum para produção de proteína heteróloga é a bactéria Escherichia coli, devido suas inúmeras vantagens, dentre elas seu rápido crescimento, seu cultivo de baixo custo, a capacidade de introdução do DNA exógeno usando um método de transformação simples além de possibilitar a produção de proteínas heterólogas em grande quantidade. No entanto expressar essas proteínas apresenta algumas dificuldades. As etapas principais para a produção de uma proteína recombinante compreendem a escolha do gene de interesse, a escolha do sistema de expressão, clonagem e expressão. Os plasmídeos de expressão bacterianos contêm, basicamente, um promotor forte e regulado e um sítio de múltipla clonagem, além de origem de replicação procariótica e do marcador genético. Os principais plasmídeos de expressão utilizam os promotores Lac, Tac e T7. O promotor Lac é semelhante ao utilizado pelas cepas tipo selvagem de E. coli, e é reprimido pela proteína lacI na ausência de indutor e induzido em sua presença. O promotor Tac contém a região operadora do Operon Trp e a região promotora do Operon Lac. Assim, ambos promotores são induzidos por lactose ou IPTG e utilizam a RNA polimerase bacteriana para transcrever o gene de interesse. O promotor T7, utiliza a RNA polimerase do fago T7, tendo como vantagem a RNA polimerase mais ativa do que a bacteriana, e nível de expressão proteica bem maior. Deve se ter em mente que o propósito será obter a proteína traduzida corretamente. Para tanto, é necessário respeitar o sinal de transcrição e tradução de genes procarióticos, além da fase de leitura e a ausência de íntrons no caso de regiões codantes de genes eucarióticos. Neste processo são necessárias clonagens subsequentes que acabam por aumentar o custo e tempo dos experimentos. Assim, o trabalho objetiva desenvolver um vetor de expressão que não necessita subclonagens, utilizando apenas um evento de clonagem e de transformação da bactéria de expressão. O constructo para expressão foi desenhado racionalmente in silico a partir de um promotor Lac responsivo a IPTG, seguido por um sinal de exportação celular (peptídeo-sinal), um fragmento strep-tag para purificação e um sítio para trombina, permitindo a clivagem da proteína de interesse dos tags fusionados. Foram inseridos dois sítios para endonucleases de restrição (BamHI e XbaI) que permitem a clivagem do gene clonado no constructo. Este que foi sintetizado artificialmente. Como perspectiva, serão realizados testes de expressão qualitativa e quantitativa com a clonagem da região codante sem íntrons do gene humano FJL7355 e determinação da função da proteína produzida e purificada.