DESENHO RACIONAL IN SILICO E SÍNTESE ARTIFICIAL DE UM CONSTRUCTO PARA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS

Resumo

Os sistemas de expressão heteróloga de proteínas tem sido extensivamente utilizados para a obtenção de proteínas específicas em quantidade suficiente para estudos de sua estrutura e função ou para aplicações clínicas e/ou industriais. O sistema mais comumente utilizado para expressão de proteínas heterólogas é o que utiliza Escherichia coli como célula hospedeira. Tal sistema é amplamente difundido devido à facilidade e baixo custo de se cultivar E. coli e pela abundância de proteínas que produz. Além disso, modificações nos vetores e linhagens de E. coli são frequentemente feitas no sentido de aumentar a eficiência e versatilidade do sistema original. Os plasmídeos de expressão bacterianos contêm, basicamente, um promotor forte e regulado e um sítio de múltipla clonagem (SMC), além de origem de replicação procariótica (OR) e do marcador genético (MG), que geralmente confere resistência a determinado antibiótico. Os principais plasmídeos de expressão bacterianos utilizam os promotores lac, tac e T7. O procedimento de clonagem de um fragmento de DNA para expressão é exatamente igual a qualquer clonagem, no entanto, deve se ter em mente que o propósito será obter a proteína traduzida corretamente. Para tanto, é necessário respeitar o sinal de transcrição e tradução de genes procarióticos, além da fase de leitura e a ausência de íntrons no caso de regiões codantes de genes eucarióticos. Neste processo são necessárias clonagens subsequentes que acabam por aumentar o custo e o tempo dos experimentos. Desta forma, o trabalho objetiva desenvolver um vetor de expressão que não necessita sublonagens, utilizando apenas um evento de clonagem e de transformação da bactéria de expressão. O constructo para expressão foi desenhado racionalmente in silico a partir de um promotor lac responsivo a IPTG, seguido por um sinal de exportação celular (peptídeo-sinal), um fragmento strep-tag para purificação e uma sítio para trombina, permitindo a clivagem da proteína de interesse dos tags fusionados. Foram inseridos dois sítios para endonucleases de restrição (X e Y) que permitem a clivagem do gene clonado no constructo, localizados entre o strep-tag e o sítio para trombina. O constructo foi sintetizado artificialmente (IDT Technologies). Como perspectiva, serão realizados testes de expressão qualitativa e quantitativa com a clonagem da região codante sem íntrons de um gene humano e determinação da função da proteína produzida e purificada.