Viabilidade da Solução Otto I Modificado com Tween 80 em Citometria de Fluxo

Resumo

As espécies Lactuca sativa (alface) e Glycine max Merr.(soja) são utilizadas como plantas padrões com referência mundial para o estudo de Citometria vegetal e Eragrostis plana Nees (capim Anoni) é a planta em estudo utilizada como padrão referência interna no Centro Interdisciplinar de Pesquisas em Biotecnologia. A solução de lise Otto I é a mais utilizada na Citometria Vegetal. O presente trabalho visou testar o uso do detergente não iônico Tween 80, na obtenção da estimativa de quantificação de DNA para espécies. Três amostras foliares de cada espécie foram coletadas e, utilizadas 100 mg de tecido foliar para a quantificação do conteúdo de DNA. O experimento foi dividido em dois partes, cada com três conjuntos de placas de Petri; a) utilização de 0,5% de Tween 20 na solução de Otto I (controle) e b) Otto I modificado com adição de 0,5% de Tween 80. Amostras foliares foram trituradas em duas places de petri para cada espécie. Na primeira placa, foi colocado 1mL de Otto I e na segunda, 1 mL de Otto I modificado (Tween 80). Os materiais triturados foram filtrados através de malhas de 100 µm e 50 µm, respectivamente; até completar 1,5 mL em tubo de 2mL. Posteriormente, estes tubos foram centrifugados a 600 RPM durante 10 minutos e os sobrenadantes foram descartados. Nos tubos com pellets, foram adicionados 1,0 mL de tampão Otto II (400mM de Na2PO2) . Estes materiais de suspensão nuclear foram coradas com 10 µL/mL de iodeto de propídeo durante 10 minutos. Para leituras das amostras das espécies, dez mil núcleos foram analisados. Os histogramas obtidos apresentaram dados inferior a 5% de CV. Os valores foram submetidos a análise de variância pelo teste F e, quando significativo os dados foram comprados pelo teste de médias Scott Knott ao nível de 5% de probabilidade. Os resultados obtidos durante estimativas da quantificação de DNA com solução de Otto I modificado apresentaram-se melhores, com a média de 7,85% nas leituras; confirmando os estudos de Loureiro et al.(2007) que demonstraram os desempenhos das soluções de isolamento de núcleos não funcionaram bem com todas as espécies, devido aos diferentes tipos de tecidos foliares e tamanhos dos genomas nucleares. Assim, a solução Otto I modificado (Tween 80) apresentou melhores performances nos isolamentos dos núcleos, aumentando sensibilidades do citómetro de fluxo, que possibilitou leituras precisas. Este estudo levou ao desenvolvimento de melhores tampões para vegetais do bioma Pampa, o que facilitará desenvolver um novo protocolo para obtenção de leituras precisas na Citometria de fluxo em vegetal.