Formação de espécies reativas de oxigênio em oócitos bovinos e no meio de maturação in vitro em diferentes tensões de oxigênio e densidade de oócitos.

Resumo

Espécies reativas de oxigênio (ROS) em níveis fisiológicos são responsáveis por várias funções celulares, mas quando há um desequilíbrio entre produção de ROS e sistema antioxidante na célula, ocorre o estresse oxidativo, levando a danos celulares. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da associação entre a tensão de oxigênio (5% ou 20%) e diferentes densidades de oócitos (1:10 ou 1:20 oócitos/µL de meio) na MIV de oócitos bovinos sobre a produção de ROS e atividade antioxidante. Oócitos bovinos (n=420) obtidos de ovários de abatedouro e distribuídos em grupos de 15 oócitos por tratamento: T1 = 1:10 em 5% O2, T2 = 1:10 em 20% O2 e T3 = 1:20 em 5% O2, e T4 = 1:20 em 20% O2, e maturados em TCM-199 modificado (5 repetições). A produção de ROS em oócitos e no meio de MIV foi avaliada pelo método de espectofluorimétrico, utilizando 2'7'diclorofluoresceína diacetato (DCHF-DA). As amostras foram incubadas com 10ul de DCHF-DA no escuro, sendo sua oxidação expressa em unidades de fluorescência (UF) para a detecção de ROS. A intensidade de emissão de fluorescência foi realizada em 520nm com excitação de 480nm, 30 minutos após a adição de DCHF-DA no meio. Os níveis de GSH foram determinados pelo método de fluorescência utilizando o-ftalaldeído (OPA). Amostras de oócitos (10 ul) foram incubadas com 10 ul de OPA (0,1% metanol) e 180 ul de tampão fosfato 0,1 M (pH 8,0) durante 15 min à temperatura ambiente no escuro. Níveis de GSH foram expressos como nmol de GSH/mL. A atividade de superóxido dismutase (SOD) foi medida com um método baseado na capacidade de SOD para inibir a auto-oxidação de epinefrina em adrenocromo (480nm). Uma unidade enzimática (IU) foi definida como a quantidade de enzima necessária para inibir a taxa de auto-oxidação em 50%, a 26ºC. Os dados foram analisados por ANOVA e teste Duncan (5% de significância). A produção de ROS nos oócitos foi superior em T1 e T3 (P<0,05) em relação a T2 e T4 (13,53 e 18,78 UF vs 7,92 e 6,15 UF, respectivamente). Por outro lado, o acúmulo de ROS no meio de MIV foi superior nos tratamentos com densidade 1:10 (T1 e T2) do que os tratamentos com uma densidade de 1:20 (T3 e T4), independentemente da tensão de oxigênio utilizada na MIV. Não houve diferença nos níveis de GSH e atividade SOD (P> 0,05). Estes resultados mostram aumento na produção de ROS em oócitos MIV sob uma atmosfera de 5% O2, em relação a atmosfera de 20% O2, independentemente da densidade de oócitos por volume de meio MIV. Por conseguinte, o acúmulo de ROS no meio de MIV foi superior quando a densidade de oócitos foi 1 oócito em 10 µL de meio MIV, independente da tensão de oxigênio utilizado. Entretanto como não foi evidenciada diferenças na avaliação dos níveis de GSH e atividade da SOD, não há como afirmar que houve estresse oxidativo durante a MIV, porém esse aumento de ROS nestes grupos pode influenciar a fecundação in vitro e desenvolvimento embrionário.