Gene Repórter Artificial L7

Resumo

A transferência gênica é uma ferramenta biotecnológica amplamente utilizada em estudos de biologia celular e molecular, que consiste na introdução de genes exógenos em células alvo. Devido ao fato de que a eficiência de transformação não atinge a totalidade das células, é necessário que as células transformadas sejam separadas daquelas não transformadas. Na atualidade, dois mecanismos são utilizados para a realização de tais processos, sendo um deles a seleção por antibióticos, uma vez que os vetores utilizados transportam genes de resistência a estes. No entanto, este procedimento é demorado e dependente, em grande parte, da inserção do material genético nas células alvo. A outra metodologia esta baseada no uso de genes repórteres fluorescentes e posterior isolamento das células pela técnica de sorter utilizando citometria de fluxo. Porém, nem todos os laboratórios dispõem deste equipamento, devido seu elevado custo. Este trabalho tem por objetivo a construção de um gene repórter que permita a seleção celular utilizando o método da streptavidina ligada a esferas magnéticas, que nós batizamos de L7. O gene repórter L7 codifica uma proteína hibrida formada pelo domínio de transmembrana da proteína CD7 e um domínio extracelular de nove aminoácidos que tem alta afinidade pela streptavidina. O gene assim formado tem um tamanho aproximado de 300pb que fornece a este gene um amplo potencial de uso em experimentos de transferência gênica. A sequencia extracelular esta localizada no extremo amino-terminal da proteína. O gene foi sintetizado mantendo o peptídeo sinal e domínio transmembrana do CD7 e uma pequena cauda citoplasmática, eliminando grande parte do domínio carboxi-terminal desta proteína. A região extracelular do CD7 foi substituída pela sequencia conhecida como streptatag que, assim como a biotina, possui afinidade com a streptavidina embora não tão forte. A metodologia utilizada para clonagem foi a técnica conhecida como costura de oligonucleotídeos e a clonagem foi realizada no plasmídeo pLR2 por PCR circular. Atualmente, aguarda-se a confirmação de sua efetiva clonagem. Assim, relatamos a produção de um gene repórter artificial com potencial de uso em experimentos de transferência gênica e seleção celular baseado no sistema biotina streptavidina.