Avaliação de Agentes Crioprotetores na Estabilidade da Enzima Beta-Galactosidase

Resumo

A β-galactosidase é uma enzima de interesse para a indústria de alimentos pois pode ser aplicada na hidrólise da lactose do leite e seus derivados e na produção de galactooligossacarídeos. E, quando obtida de microrganismos, é intracelular. A permeabilização celular permite obter enzimas intracelulares, poupando as células de tratamentos drásticos. Métodos de conservação devem ser empregados para manter a estabilidade e viabilidade dos compostos intracelulares obtidos. A liofilização é um método de conservação, onde ocorre a sublimação da fase aquosa do produto congelado a baixa pressão e temperatura. Esse método é atrativo para uso com enzimas, visto que estas tendem a desnaturar a altas temperaturas. Agentes crioprotetores são empregados para proteger as estruturas proteicas de condições estressantes durante as etapas da liofilização, evitando perdas da atividade e aumentando sua estabilidade. Este trabalho teve como objetivo avaliar agentes crioprotetores, em relação à atividade da β-galactosidase, na liofilização de células permeabilizadas da levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7082. Foram testados 6 agentes protetores: sulfato de amônio, PEG 6000, CMC (carboximetilcelulose), sorbitol, xilose e glicina. Foi realizado um ensaio utilizando tampão acetato de sódio 200 mM, pH 7,0 no lugar dos agentes protetores. A enzima foi produzida por cultivo submerso, empregando lactose como substrato. As células foram permeabilizadas com álcool metílico 35% (p/v). Em seguida foram adicionados 450 mg de biomassa (peso seco) em 10 mL de cada agente crioprotetor preparados em tampão acetato de sódio 200 mM, pH 7,0, na concentração de 1,25% (p/v). Estas suspensões foram congeladas por 24 h e após liofilizadas por 24 h. O acompanhamento da atividade enzimática foi realizado antes do congelamento, imediatamente após a liofilização e nos tempos 7, 14, 21, 30 dias. A partir do trigésimo dia, será feito o acompanhamento da atividade enzimática mensalmente. Avaliando os resultados das atividades enzimáticas das células com os agentes crioprotetor observa-se que o sulfato de amônio, o CMC e a xilose apresentaram maiores valores de atividade antes do congelamento, indicando que esses agentes não foram eficazes na proteção da enzima. O mesmo comportamento ocorreu com as enzimas liofilizadas em tampão. Já, as células com os agentes PEG 6000, sorbitol e glicina apresentaram valores de atividade maiores após a liofilização, indicando que o processo de congelamento e liofilização permeabilizaram ainda mais as células e esses agentes protegeram os sítios ativos da enzima, favorecendo sua estabilidade. O PEG 6000 apresentou um aumento de 115% na atividade enzimática após a liofilização, ao passo que para o sorbitol e glicina o aumento foi de 54% e 18%, respectivamente. Ao longo do tempo de armazenamento, observou-se uma pequena perda na atividade da enzima até o presente momento, sendo a menor perda apresentada pelo PEG 6000.