EXTRAÇÃO DE DNA DE DESMODESMUS SP. COM PROTOCOLO CTAB 2% (DOYLE & DOYLE, 1987) ADAPTADO

Resumo

As microalgas constituem um importante grupo de organismos fotossintetizantes, sendo a base da cadeia alimentar. São seres capazes de produzir metabólitos de grande interesse biotecnológico, com interessante aplicabilidade na indústria farmacêutica, cosmética e alimentícia. A simplicidade da sua estrutura, aliada a altas taxas de produção de biomassa em um curto período de tempo, favorecem a sua investigação. Sua correta identificação é de grande importância, visto que esses organismos apresentam um grande potencial, entretanto, a taxonomia clássica não tem sido suficiente para essa finalidade. A taxonomia molecular, adentra nesse cenário como uma opção vantajosa, para elucidar problemas taxonômicos, a partir da análise de regiões específicas. Desse modo, o presente trabalho teve como finalidade adaptar o protocolo CTAB 2% (Doyle & Dolyle, 1987), utilizado em plantas superiores, para extração de DNA da microalga Desmodesmus sp.. A extração foi realizada com aproximadamente 0,370 mg de biomassa fresca, obtidas por centrifugação de 50 mL do cultivo. A amostra foi inicialmente macerada para quebra da parede celular, posteriormente, transferida para um tubo tipo eppendorf, submetida aos processos de separação do DNA dos demais componentes celulares através da adição de 700 µL de CTAB 2%, seguida de 2 µL de 2-ß-Mercaptoetanol, e incubada em banho-maria por 35 min. à uma temperatura de 65oC. Posteriormente, foi procedida a adição de 700 µL de Álcool Isoamílico, seguido de centrifugação a 14.000 rpm/min., por 5 min., obtendo-se a separação das fases celulares. Aproximadamente 600 µL de sobrenadante foram transferidos para um segundo tubo, onde foi adicionado 700 µL de isopropanol gelado e deixado em overnight por 8 horas, para a precipitação do DNA. Após, o material foi centrifugado a 12.000 rpm/min. por 5 min., no fim dessa etapa, o conteúdo do tubo foi descartado, a fim de obter somente o pellet, uma fina película de DNA concentrada no fundo do tubo. A etapa seguinte consistiu no processo de lavagem do DNA, com álcool 70% e 96%, seguidas de centrifugação. Por último, a eluição foi feita adicionando TE. O produto final foi quantificado em aparelho NanoVue®, apresentando uma concentração de 199,0 ng/µL. A funcionalidade da extração foi testada através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), com oligonucleotídeos iniciadores (primers), prospectados para a região 18s. Diante dos resultados obtidos, a proposta do presente trabalho foi atingida pela obtenção de boas quantidades de DNA extraídos de Desmodesmus sp. para o protocolo de CTAB 2%, utilizando maceração manual. Demonstramos que a extração de DNA do microrganismo em questão pode ter custo atenuado, reduzindo a concentração do CTAB e a utilização do 2-ß-Mercaptoetanol em substituição a enzima RNAase.