APLICAÇÃO DE ESRESSE CONTROLADO ATRAVÉS DE PRESSÃO NEGATIVA NA CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EQUINO

Resumo

A criopreservação do semên equino é uma biotécnica de reprodução que tem como objetivo garantir o melhoramento genético através do congelamento e descongelamento, maximizando a utilização de garanhões. Entretanto, sabe-se que esse processo leva a um estresse térmico, mecânico, químico e osmótico que pode reduzir a fertilidade. Alguns trabalhos têm sugerido que a submissão de células, gametas e embriões a um estresse subletal controlado pode influenciar positivamente na criotolerância. Dentre os tipos de estresse utilizados a pressão hidrostática positiva é a mais utilizada. Contudo, outras formas de fornecimento de estresse já foram testadas como variação térmica, estresse osmótico e pressão negativa. A pressão negativa tem sido utilizada para melhorar a criopreservação de oócitos e embriões bovinos, células somáticas e sêmen de carneiro. Este trabalho tem como objetivo avaliar a cinética de espermatozoides criopreservados submetidos a diferentes intensidades de pressões negativas. Foram utilizados 13 ejaculados de quatro garanhões sadios com idade média de 12,5±5,5 anos. Todos os animais apresentaram saúde reprodutiva e foram mantidos nas mesmas condições em piquetes com pastagem de campo nativo, água e sal mineral ad libitum, sendo suplementados com 1,5% de concentrado. Os garanhões tiveram suas reservas seminais extra gonadais esgotadas para que desse início ao experimento. As coletas de sêmen foram realizadas com vagina artificial (modelo Botucatu). Após as coletas, o sêmen foi diluído com Botusêmen® na proporção 1:1 (sêmen:diluente). Posteriormente, o ejaculado diluído foi transportado até o laboratório em caixa térmica sob refrigeração a 15ºC. No laboratório foram realizadas análises imediatas: Motilidade total, progressiva e vigor. Ainda foram realizadas coloração supravital e verificação de patologias espermáticas para que essas amostras pudessem ser incluídas no experimento. Os parâmetros mínimos para liberação do ejaculado, seguiram o preconizado pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. Após as análises iniciais o ejaculado foi dividido, de forma homogênea em tubos de 15mL, nos grupos experimentais: Controle (sem exposição a pressão negativa), P200 (exposto a pressão negativa de 200 mbar), P500 (exposto a pressão negativa de 500 mbar), P800 (exposto a pressão negativa de 800 mbar). A técnica de exposição à pressão negativa respeitou o tempo de 15 minutos no total, onde se utilizou uma a bomba de vácuo Vix® (¼ hp 60Hz) acoplada a uma câmara de pressão que forneceu uma atmosfera de 200 a 800 mbar. Após o período de exposição à pressão o sêmen foi centrifugado a 600x G por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido em diluente Botucrio®, sendo a concentração espermática ajustada a 100x106 sptz/ml. Os espermatozoides foram envasados em palhetas de 0,5 ml e congelados na máquina automatizada TK 3000. A curva de resfriamento utilizada foi de 0,5ºC/ min e a curva de congelamento -20ºC/mim até que fosse atingida a temperatura de -60ºC. Posteriormente as palhetas foram imersas em nitrogênio líquido e estocadas em botijões a -196ºC até o momento das avaliações. O procedimento de descongelamento seguiu o protocolo preconizado pelo Laboratório de Produção e Reprodução Equina (descongelamento em banho-maria a 37ºC/ 30 segundos). Posteriormente, foi realizada a análise computadorizada da cinética espermática (CASA). As variáveis mensuradas foram as seguintes: motilidade total, motilidade circular, motilidade rápida, motilidade lenta, motilidade local, motilidade progressiva e imóveis. Estas análises foram realizadas no laboratório de reprodução animal (REPROLAB/UFRGS). As variáveis foram analisadas utilizando o pacote estatístico SPSS com teste de Tukey com nível de significância de 5%. Os resultados estão expressos em média e desvio padrão. Os resultados obtidos demonstraram que as pressões negativas não influenciaram nas variáveis de cinética espermática. Os valores médios obtidos para a variável motilidade total nos diversos tratamentos (controle: 45,93±14,11%; P200: 43,19±10,76%; P500: 45,05±12,19%; P800: 41,20±13,20%) não foram diferentes (p>0,05). Os resultados obtidos em relação a motilidade total (Controle:45,9 ± 14,1%; P200: 43,18±10,8%; P500: 45,0±12,1%; P800: 41,2±13,2), motilidade circular (Controle:1,9±1,2%; P200:2,3±0,9%; P500:2,4±1,0%; P800:1,6±1,2%), motilidade rápida (Controle: 6,7±3,7%; P200: 5,5±1,8%; P500: 6,0±4,2%; P800: 4,1±2,3%), imóveis (Controle: 54,0±14,1%; P200: 56,6±10,9%; P500: 54,9±12,1%; P800: 58,7±13,1%), motilidade lenta (Controle: 20,3±10,2%; P200: 17,4±6,4%; P500: 16,8±7,4%; P800: 15,3±8,9%) e motilidade local (Controle: 16,8±6,5%; P200: 17,9±5,9%; P500: 18,2±6,6%; P800: 19,9±8,1%) não apresentaram diferença estatística entre os grupos controle e as diferentes pressões. Desta forma, concluímos que a submissão de espermatozoides equinos a um estresse controlado por meio de diferentes pressões negativas não alteram a cinética espermática.