TAXA DE RECUPERAÇÃO ESPERMÁTICA UTILIZANDO OS GRADIENTES DE PERCOLL

Resumo

As biotecnologias empregadas na bovinocultura estão tomando cada vez mais espaço no cenário atual. Nessa crescente temos a inseminação artificial em tempo fixo (IATF) e a Fertilização in vitro (FIV), como técnicas em expansão. A quantidade e qualidade dos espermatozoides dos touros, estão relacionadas diretamente ao sucesso do emprego dessas biotecnologias, trazendo assim como pauta a importância de técnicas para uma melhor seleção de espermatozoides viáveis. A seleção espermática por gradientes de Percoll é utilizada para uma recuperação espermática mais eficaz selecionando espermatozoides de melhor qualidade. Ele consiste na formação de um gradiente gradual, onde a densidade aumenta do sentido da camada superior para a inferior, resultando em um pellet de sêmen mais concentrado, assim sendo selecionados apenas espermatozoides viáveis para a aplicação em técnicas, projetos e pesquisas futuros, deixando no sobrenadante os restos celulares e espermatozoides inviáveis. Sabe-se que a taxa de recuperação espermática apresenta um papel fundamental em biotécnicas com FIV, pois dependendo da eficiência da técnica empregada, uma dose de sêmen pode ser utilizada para até 20 doadoras. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a taxa de recuperação espermática obtida em nosso laboratório utilizando o método de seleção por mini percoll 45-90%. Para o estudo foram realizadas 7 repetições utilizando um pool com o sêmen de 4 touros de fertilidade conhecida, onde palhetas de 0,25mL foram descongelados em banho maria a 37ºC por 20¨, sendo a seguir o sêmen avaliado quanto a motilidade, motilidade progressiva, vigor e concentração espermática inicial. A seguir o sêmen restante (Volume inicial) 600 μL, foi divido igualmente em 4 tubos contendo os gradientes de percoll, (400 μL de 90% + 400 μL de 45%), sendo os tubos centrifugados por 5 min a uma força de 4000 rpm (Rotações por minuto). Os pellets (100uL) resultantes foram divididos em 2 tubos cônicos contendo 300 μL de Fert TALP (37 ºC), e centrifugados novamente a 4000 rpm por 1 minuto. O pellet resultante da segunda centrifugação (100 uL) originou o volume final que foi avaliado quanto a motilidade, motilidade progressiva, vigor e concentração espermática final. Para calcular a taxa de recuperação (TR), foi utilizada a fórmula: TR: [ ] Final x volume final / [ ] inicial x volume inicial, x 100. Os resultados na taxa de recuperação espermática, foram de 26%, 51%, 49%, 37%, 39%, 56%, 37% nas repetições de 1 a 7, respectivamente. A taxa média de recuperação espermática no experimento foi de 40,6%. Dados da literatura indicam que recuperação espermática acima de 30% já são consideradas positivas. Considerando que em 5 das 7 repetições, foi obtido uma eficiência na recuperação espermática obtendo-se uma média superior a 30%, podemos considerar que este protocolo esta bem estabelecido no laboratório, no entanto a motilidade espermática inicial, bem como a correta pipetagens nas diferentes etapas podem ser fatores responsáveis pelas oscilações e devem ser constantemente controlados. Baseado nos resultados obtidos foi possível concluir que o método de gradientes de percol em 45 e 90% se mostrou eficiente na recuperação de espermatozoides bovinos para experimentos de reprodução assistida, pois permite a seleção de até 4 palhetas de forma simultânea, sem interferir na taxa de recuperação espermática. Esse estudo tem como intuito mostrar a importância da seleção de espermatozoides viáveis, pois a qualidade dos mesmos está diretamente ligada aos resultados que serão obtidos.