ATIVIDADE DA ATPASE MIOSÍNICA E SEUS PARÂMETROS CINÉTICOS FRENTE AO EXTRATO DE FOLHAS DE BLEPHAROCALYX SALICIFOLIUS

  • Ariane Pereira Carvalho
  • Cleci Menezes Moreira
Rótulo Miosina, Blepharocalyx, salicifolius, Murta, ATPase

Resumo

Através do conhecimento popular, muitas plantas são utilizadas para tratamento de diversas doenças, com isso, estudos com elas são fundamentais para comprovação dos seus efeitos. Uma destas plantas populares é a Murta (Blepharocalyx salicifolius), pertencente à família Myrtaceae. Esta planta é utilizada pela população como tendo efeitos digestivo, antidiarreico, antiespasmódico e hipotensor. A miosina cardíaca é a proteína com um sítio catalítico para hidrólise do ATP, responsável pela força gerada para contração muscular. Através da medida da atividade ATPásica da miosina pode-se inferir se extratos de plantas possuem efeito inotrópico cardíaco, uma vez que a sua atividade libera fosfato iorgânico (Pi) para geração de força do miócito. O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação do extrato aquoso das folhas da Blepharocalyx salicifolius na atividade da ATPase miosínica cardíaca e determinar seus parâmetros cinéticos. Para isso, foi preparado o extrato aquoso das folhas secas e trituradas (5%), através de infusão a 80°C, por 15 min, e posteriormente foi liofilizado. Para a extração da miosina, o ventrículo esquerdo de ratos Wistar machos (006/2021, Ceua), 3 meses de idade, (n=4), foi homogeneizado em solução tampão fosfato 150 mM contendo 0,6 M de KCl, pH 6,5. A miosina solubilizada pela ação de alta força iônica foi precipitada através da adição de água, centrifugada a 30.000 xg por 30 min. Este procedimento foi realizado duas vezes para a extração da miosina. O ensaio da atividade enzimática foi realizado em um tampão (pH 7,0) contendo 50 mM de HEPES; 5mM de CaCl2; 0,6 M de KCl; sendo ATP (1mM) o substrato, em um volume final de 200 µL, a 30°C. A reação foi interrompida pela adição de ácido tricloroacético a 10%. O fosfato liberado, foi determinado pelo método de Chan. A atividade específica da enzima foi expressa como fosfato inorgânico liberado pela hidrólise do ATP, em nmol de Pi/min/mg de proteína, e a proteína foi quantificada pelo método de Bradford, utilizando albumina bovina (1 mg/mL) como padrão. Foram testadas concentrações de 125, 625 e 1250 µg/mL do extrato para a determinação do efeito na atividade especifica da enzima. Posteriormente foi realizada uma curva de substrato nas concentrações de 0,15; 0,25; 0,50 mM de ATP, frente a três concentrações de extrato (125, 250 e 350 µg/mL), para a determinação do tipo de inibição causada. A análise estatística foi realizada por ANOVA de 1 via, seguido de post hoc de Tukey, *p<0,05 foi considerado significativo. Os resultados em % de atividade do controle, foram: 68,01%; 41,54%*; 17,96%* respectivamente para 125; 625; 1250 µg/mL. Foi calculado um valor de IC50 de 629,0 µg/mL, que é a concentração capaz de causar 50% de inibição da atividade. A inibição da atividade enzimática se deu de maneira concentração dependente. A partir dos dados da curva de substrato, construímos o duplo recíproco de Lineweaver-burk, onde plota-se 1/Vmax versus 1/[Substrato, ATP]. Este plot mostrou uma inibição do tipo competitiva, pois o km aumentou na presença do seu inibidor (extratos da planta) e a velocidade máxima não se modificou. Valores de Km de 0,125, 0,228; 0,309; 0,474 mM para sem inibidor, 125, 250, 350 µg/mL de extrato, respectivamente). Valores de Vmax de 178,6; 175,4; 181,8; 175,4 nmol de Pi/min/mg de proteína, respectivamente para sem inibidor, 125, 250 e 350 350 µg/mL de extrato). Esses resultados mostraram que o extrato aquoso da Blepharocalyx salicifolius foi capaz de inibir a atividade da ATPase miosínica a partir da concentração de 625 µg/mL de maneira dose dependente e com a inibição do tipo competitiva. Estes resultados, são os primeiros estudos realizados com a atividade desta enzima e seus parâmetros cinéticos, determinados in vitro, frente a extratos vegetais, sugerindo que esta planta pode apresentar um possível efeito inotrópico negativo ao miocárdio.

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Publicado
2021-11-16
Como Citar
PEREIRA CARVALHO, A.; MENEZES MOREIRA, C. ATIVIDADE DA ATPASE MIOSÍNICA E SEUS PARÂMETROS CINÉTICOS FRENTE AO EXTRATO DE FOLHAS DE BLEPHAROCALYX SALICIFOLIUS. Anais do Salão Internacional de Ensino, Pesquisa e Extensão, v. 13, n. 3, 16 nov. 2021.